实验步骤

一、 样品准备

1． 准备好 25cm2细胞培养瓶或 60mm 细胞培养皿的待测培养细胞（1 至 5 X 10 6细胞）

2． 小心加入 xx 毫升清理液（Reagent A），覆盖生长表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）

5． 加入 xx 毫升清理液（Reagent A），混匀细胞

6． 移入到预冷的 15 毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）

7． 放进 4℃台式离心机离心 5 分钟，速度为 300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入 xx 微升裂解液（Reagent B），充分混匀

10．转移到预冷的 1.5 毫升离心管

11．涡旋震荡 5 秒，充分混匀

12．即刻放进预冷的 DOUNCE 匀浆器

13．在冰槽里用研磨棒匀化组织（约 80 下）

14．将所有细胞匀浆物移入 15 毫升锥形离心管

15．放进 4℃台式离心机离心 5 分钟，速度为 10000g

16．小心移取 500 微升上清液到新的预冷的 1.5 毫升离心管——此为总蛋白样品

17．放进 4℃超速离心机离心 60 分钟，速度为 100000g

18．小心抽去上清液

19．加入 xx 微升裂解液（Reagent B），混匀颗粒群——此为微粒体样品

20．移取 10 微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒－G&VS30030.1）

21．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、 测读准备

1． 准备好待测样品，置于冰槽里融化

2． 设定好分光光度仪或酶标仪：温度 25℃，波长 424nm，间隔 30 秒，测读 7 次（共 3 分钟），并置零

3． 缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度

三、 样品背景对照测定

1． 移取 xx 微升缓冲液（Reagent C）到新的 200 微升比色皿

2． 加入 20 微升待测样品（注意：建议总量 200 微克微粒体蛋白）

3． 加入 xx 微升反应液（Reagent D）

4． 在 25℃温度下孵育 5 分钟

5． 加入 xx 微升阴性液（Reagent F）

6． 上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内）

7． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品背景空对照（注意：参见注意事项 10）

四、 样品活性测定

1． 移取 xx 微升缓冲液（Reagent C）到新的 200 微升比色皿

2． 加入 20 微升待测样品（注意：建议总量 200 微克微粒体蛋白）

3． 加入 xx 微升反应液（Reagent D）

4． 在 25℃温度下孵育 5 分钟

5． 加入 xx 微升底物液（Reagent E）

6． 上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内）

7． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品活性读数（注意：参见注意事项 10）

五、 计算样品活性

六、酶标板测定

1． 在 96 孔板上做好相应标记：样品背景对照和待测样品活性

2． 分别移取 xx 微升缓冲液（Reagent C）到 96 孔板中的所有孔里

3． 分别加入 20 微升待测样品（注意：建议总量 200 微克微粒体蛋白）到所有孔里

4． 分别加入 xx 微升反应液（Reagent D）到所有孔里

5． 轻轻摇动 96 孔酶标板

6． 在 25℃温度下孵育 5 分钟

7． 加入 xx 微升阴性液（Reagent F）到样品背景对照孔里

8． 加入 xx 微升底物液（Reagent E）到待测样品活性孔里

9． 轻轻摇动酶标板（限定在 3 秒之内）

10．即刻放进酶标仪检测：获得吸光读数（注意：参见注意事项 10）

11．活性计算：

注意事项

1． 本产品为 20 次操作

2． 操作时，须戴手套

3． 样品忌用 DTT 和巯基乙醇等处理

4． 样品背景和样品活性需平行检测

5． 比色测定后，比色皿须清洗che底

6． 反应物混合后 3 秒内进行光谱测定

7． 光谱测定后，比色皿须清洗che底

8． 通常背景空对照的吸光读数会呈现降低，表明样品中含有细胞色素 b5 还原酶的干扰以及细胞色素 b5

的自发氧化

9． 样品 0 分钟读数通常和背景空对照 0 分钟读数理论上一致

10．样本测定 3 分钟读数低于 0 分钟读数表明具有酶活性

11．建议选择样品读数开始下降后的 1 分钟 OD 值作为活性读数（initial rate），同时选择平行时间的背景

OD 值作为背景对照读数

12．如果酶活性过低，可以延长反应时间

13．建议待测样本为微粒体，其蛋白浓度为 100 微克/10 微升 （本公司提供 Bradford 蛋白质浓度定量试

剂盒 G&VS30030.1）

14．如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度

15．硬脂酰辅酶 A 去饱和酶活性单位浓度定义：在 25℃室温下，pH 8.0 的情况下，每单位酶在单位时间内（每分钟）再氧化 1 微摩尔的细胞色素 b5

16．本公司提供系列酶学检测试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定检测敏感

使用cheng诺

极威生物秉着“信誉至上、客户满意、质量cheng诺”的宗旨为我们的用户提供you质产品和服务。用户收到货后，

应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，bao证

说明书所述的使用效果。在货到后 10 天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）

与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作

所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒

IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。

订购信息

单组分订购信息

编号               名称                          规格

G&VS50610.1 细胞硬脂酰辅酶 A 去饱和酶活性gao效液相色谱比色法定量检测试剂盒                 20 次

G&VS50610.1A          清理液（Reagent A）                 毫升

G&VS50610.1B          裂解液（Reagent B）                 毫升

G&VS50610.1C           缓冲液（Reagent C）                 毫升

G&VS50610.1D          反应液（Reagent D）                 毫升

G&VS50610.1E          底物液（Reagent E）                 毫升

G&VS50610.1F          阴性液（Reagent F）                 毫升

试剂盒订购信息

产品编号                 名称                 规格

G&VS50492.1细胞硬脂酰辅酶 A 去饱和酶（STEAROYL COA DESATURASE）活性gao效液相色谱（HPLC）比色法定量检测试剂盒                 20 次

G&VS50492.2组织硬脂酰辅酶 A 去饱和酶（STEAROYL COA DEHYDROGENASE）活性gao效液相色谱（HPLC）比色法定量检测试剂盒                 20 次

G&VS50493.1细胞硬脂酰辅酶 A 去饱和酶（STEAROYL COA DESATURASE）活性薄层色谱（TLC）同位素法定量检测试剂盒                 20 次

G&VS50493.2组织硬脂酰辅酶 A 去饱和酶（STEAROYL COA DEHYDROGENASE）活性薄层色谱（TLC）同位素法定量检测试剂盒                 20 次

G&VS50610.1细胞硬脂酰辅酶 A 去饱和酶（STEAROYL COA DESATURASE）活性光谱法定量检测试剂盒                 20 次

G&VS50610.2组织硬脂酰辅酶 A 去饱和酶（STEAROYL COA DEHYDROGENASE）活性光谱法定量检测试剂盒                 20 次

原创作者：上海极威生物科技有限公司